產(chǎn)品規(guī)格：50T，100T

產(chǎn)品內(nèi)容：

儲(chǔ)存條件：4℃避光冷藏，請勿凍存。有效期見外包裝。

光譜特性 

     FITC-Annexin V: Abs/Em = 494/518 nm

     PI: Abs/Em = 535/617 nm (with DNA)

產(chǎn)品介紹 

     FITC-Annexin V 和 PI 凋亡試劑盒提供了一種快速簡便的方法，通過標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞（綠色）和壞死細(xì)胞（紅色），用于檢測細(xì)胞凋亡水平。產(chǎn)品可以使用流式細(xì)胞儀或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

     FITC-Annexin V 可以標(biāo)記凋亡細(xì)胞。Annexin V 選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱 PS)。在細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時(shí)，PS 會(huì)外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。用綠色熒光探針 FITC 標(biāo)記的 Annexin V，即 FITC-Annexin V，可以結(jié)合外翻的磷酯酰絲氨酸，從而檢測細(xì)胞凋亡的重要特征。 

     碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料，它可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞的細(xì)胞核。PI 可以由 488,532 或 546 nm 的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。

使用方法 

     下列實(shí)驗(yàn)方案以利用星形孢菌素誘導(dǎo) Jurkat 細(xì)胞凋亡為例，如果使用其他誘導(dǎo)劑和其他類型的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)條件需要略作調(diào)整。

一、流式細(xì)胞檢測 

1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，作為陰性對照。此外，設(shè)定一組樣品做單染， 用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。 

2. 收集細(xì)胞。懸浮細(xì)胞：300 g，4℃離心 5 min 收集細(xì)胞；貼壁細(xì)胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后 300 g，4℃離心 5 min收集細(xì)胞，胰酶消化時(shí)間不宜過長，以防引起假陽性。

     注：用胰蛋白酶消化然后使細(xì)胞在最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng) 基中恢復(fù)約30分鐘，然后再染色。 胰蛋白酶消化會(huì)暫時(shí)破 壞質(zhì)膜，允許Annexin V結(jié)合磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞膜的細(xì)胞 質(zhì)表面上，從而導(dǎo)致假陽性染色。

3. 用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次均在 300 g，4℃下離 心 5 min，收集 1-5×105 個(gè)細(xì)胞并用100 μL 1×結(jié)合緩沖液 重懸細(xì)胞。 

4. 每管加入 4-5 μL 的 FITC-Annexin V 和 5 μL 的 PI工作液。 

     注：我們推薦準(zhǔn)備兩管額外的流式管，每管只加入一種單染染料（FITC-Annexin V 和PI），用于流式單染的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。

5. 室溫避光孵育 10-15 min，為避免細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過程可在冰上操作。 

6. 每管加入 400 μL 的 PBS 或 1×結(jié)合緩沖液，盡快通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。FITC-Annexin V 可以由 488nm 激光激發(fā)，檢測熒光發(fā)射光譜約在 530 nm 處（FITC 通道），PI 通道發(fā)射光譜約在 617 nm 處（注：PBS 或 1×結(jié)合緩沖液的選擇根據(jù)不同凋亡處理以及不同細(xì)胞具體選擇）。

二、熒光顯微鏡檢測

     對于懸浮細(xì)胞，可參照流式細(xì)胞檢測的方法進(jìn)行具體操作。 

1. 在蓋玻片或載玻片小室中接種細(xì)胞。 

2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處 理的細(xì)胞樣品，作為陰性對照。 

3. 用PBS 洗滌細(xì)胞。 注：細(xì)胞收集后如果不用 PBS 清洗，可以用含血清的培養(yǎng) 基直接替代Annexin V 結(jié)合緩沖液，但是 Annexin V 的使用濃度需要重新優(yōu)化。 

4. 每 100 μL 的 Annexin V 結(jié)合緩沖液中加入 5-25 μL的FITC-Annexin V 和 5 μL 的PI。 

     注：最佳使用濃度由具體實(shí)驗(yàn)要求確定。

5. 向培養(yǎng)板中加入足量的染液以覆蓋全部細(xì)胞，室溫避光 孵育 15-30 min。為避免細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時(shí)間至少延長至 30 min。 

6. 用 1×結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞。 

7. 將孵育有細(xì)胞的蓋玻片置于載玻片上，載玻片可提前加一滴 1×結(jié)合緩沖液；對于培養(yǎng)在小室內(nèi)的細(xì)胞，可直接加 入足量的 1×結(jié)合緩沖液覆蓋細(xì)胞。 

8. 使用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞 。FITC-Annexin V 可用 FITC 適用的濾光片，PI 可用 Cy3 或者 Texas。

注意事項(xiàng)： 

1. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。 

2. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。